傳染病病原快速鑒定與溯源新技術的探索與挑戰(zhàn)

目錄

• 1、闞飆：CDC細菌性傳染病監(jiān)側需要什么樣的介子介型技術

• 2、夏勝利：腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術探索

• 3、楊瑞馥：高通量核酸側序技術在應對新發(fā)、突發(fā)傳染病中的作用

• 4、扈慶華：食源性疾病的快速診斷和溯源

【精彩發(fā)言】

1、闞飆：CDC細菌性傳染病監(jiān)側需要什么樣的介子介型技術

我們探討的傳染病暴發(fā)，實際上包含了幾個不同的形式：第一種是一段短時間內在局限的地區(qū)出現(xiàn)了很多相似的病例，這個就叫暴發(fā)了，這是暴發(fā)的一種形式。但是現(xiàn)在面臨一個問題：有時也有一些暴發(fā)，病例是出現(xiàn)在不同的地方，各地看起來像單個病例，但實際是暴發(fā)病例分散開了，尤其是早期，所以，如何發(fā)現(xiàn)暴發(fā)，是當前面臨的重要問題。對于傳染病監(jiān)測，我們流行病學調查了很多信息，實驗室里也檢測到很多的信息，還有臨床上的信息。這些匯總起來，最后形成病例的個案信息，來幫助我們進行判斷，尋找暴發(fā)以及溯源的蛛絲馬跡。

目前我們使用的傳染病網絡直報系統(tǒng)，是要通過監(jiān)測來發(fā)現(xiàn)暴發(fā)和溯源，對于流行病學人員，要發(fā)現(xiàn)暴發(fā)，而且能夠找到原因，找到引起暴發(fā)的問題，然后切斷擴散途徑，那就控制了。對于微生物學人員，主要工作包括檢測，需要認識病原是什么，并通過病原學證據(jù)敏感提示可能的暴發(fā)，并回溯到源頭。

對于傳染病檢測中的實驗室數(shù)據(jù)已經不能忽略了。在傳染病口常監(jiān)測和疫情調查當中，我們會得到菌株，然后進行分子分型，再放到分型數(shù)據(jù)庫進行查找比對，形成報告，提示可能的問題，同時再開展流行病學調查分析。實驗室里通過對菌株分子分型發(fā)現(xiàn)成簇型別的菌株，由此提出是否有暴發(fā)的問題，隨后啟動流行病學調查分析，一起來確認暴發(fā)，并采取行動，這個是實驗室監(jiān)測中通過分子分型來發(fā)現(xiàn)暴發(fā)做檢測的途徑。用這些病原體分子分型技術，是從病原學的角度切人來尋找問題，包括提示與確定暴發(fā)、發(fā)現(xiàn)傳播鏈、尋找傳染來源，以及包括擴散到什么范圍等內容。這里給大家展示一個視頻(視頻略)，是當時的美國副總統(tǒng)戈爾的一段講述病原菌分子分型用于暴發(fā)發(fā)現(xiàn)和調查的視頻。另外有一個例子，通過利用菌株的分子分型技術來做傳染病的監(jiān)測，把分散在美國、日本的散發(fā)痢疾病例菌株進行分析，通過圖譜相同的現(xiàn)象來提示有共同問題，隨后通過流行病學的調查在夏威夷找到了源頭，能夠顯示出，分散的病例實際上是暴發(fā)病例。

要用這個分析方法，就是基于病原體分子分型的傳染病監(jiān)測，根據(jù)共同感染來源的菌株是相同的這一現(xiàn)象和依據(jù)，幫助我們從病原學的角度來發(fā)現(xiàn)問題，尋找引起暴發(fā)的因素。這些病人分散到不同地區(qū)，我們一般不去關注感染源到底來自哪個地方，因為表面上看是散發(fā)病例，而口常監(jiān)測中我們沒有時間、沒有精力來對每個病例做流行病學調查。

剛才提到的例子，對于我們是比較常見的疾病，沒有流行病學人員喜歡去做腹瀉病的流調，因為太普通了，也產生不了什么影響力，但是這恰恰是一類考驗流行病學人是不是真正具有很深厚的流行病學調查能力的考題。對于如何病例定義，我舉個例子，對于腹瀉的調查，一般是將具有拉肚子癥狀的病人作為病例，然后再找對照。畢竟腹瀉太常見，我們限定一下病例的定義，確定是哪個地方哪段時間的腹瀉病例，成為調查的病例。又因為腹瀉有病毒感染、細菌感染，有嘔吐、發(fā)熱等，癥狀也略有差異，為更精確將我們要找的那種因素導致的腹瀉病例納人真正病例組，我們又加一點關于時間的內容，比如近兩周某個地方的腹瀉伴發(fā)熱的病例。再明確一點，比如近兩周某某縣的鼠傷寒沙門菌感染病例。這實際上依然是籠統(tǒng)的，因為某個地區(qū)的具有定義癥狀的、并有鼠傷寒沙門菌引起的病例仍較多，且會由不同因素引起。既然一個暴發(fā)是由共同一個原因、一個病原引起，此時我們加上這個菌株的分子分型信息，將病例組病例定義為近幾周某某縣具有JPXXO1B0865PFGE帶型的鼠傷寒沙門菌感染病例，這樣排除了由其他感染來源導致的具有相似癥狀的病例，將病例組病例盡可能局限為一個共同因素、相同菌株引起的腹瀉病例，這樣突出了危險因素的OR值，能促進感染因素的發(fā)現(xiàn)。這是針對暴發(fā)調查和溯源的層面來做病例定義。

這有一個很具體的例子，是美國的一起腹瀉暴發(fā)調查，這個圖(圖略)想突出的是從9月6口一直到1月24口。這當中大概有600多個鼠傷寒沙門菌感染病例。實際上，美國全年大概有實驗室分離到鼠傷寒沙門菌的病原確診感染病例6000例，半年也得有3000例，為什么這3000例病例當中的2400例不去調查，只是調查這600多例?就是因為病例定義中加了分子分型，感染了具有這種圖譜的鼠傷寒沙門菌的病例才劃為病例組，其他的2400例感染者的鼠傷寒沙門菌菌株，因不是這個型，就暫時不做調查了，因為這些人可能感染了不同的鼠傷寒沙門菌，感染的因素不是要調查的。為什么這個調查費了這么多時間?是因為用了這個定義來確定病例組以后，雖病例組病例菌株都具有這個帶型了，進行流行病學調查的時候，發(fā)現(xiàn)這個人吃了這個食品、那個人吃了那個食品。與以前的暴發(fā)調查不一樣，發(fā)現(xiàn)這些病例的可能食品不一樣。最終調查答案是由美洲花生公司供應的花生醬給食品加工廠，食品加工廠拿了污染的花生醬加工成各種產品，然后再供應給消費者，最后形成這么大范圍的暴發(fā)，而且這些病例是感染了相同或非常相似圖譜的菌株，但來源食品不一樣。而食品不一樣也只是表象，實際上這些不同食品有個共同污染來源，是用作原材料的污染花生醬。

這個例子中就是從病原特征人手來做暴發(fā)調查，顯示分離菌株分子分型在暴發(fā)發(fā)現(xiàn)和溯源調查中的重要作用?；氐轿覀兊闹黝}，我們要什么樣的分子分型，而且是CDC需要的?現(xiàn)在有很多的表型分型方法，分子分型方法也有很多，我們要什么樣的?要求分辨力強、操作簡便、重復性好、易于標準化、做一次實驗便宜，而且要快速。另外，不依賴病原分離的方法更好，也是為了提高分析速度，盡快發(fā)現(xiàn)菌型問題和開展流行病學調查。

當然這幾條當中，簡便就是好操作、重復性好就是穩(wěn)定。一些方法今天做是這樣的結果，明天做是那樣的結果，就沒有辦法用。易于標準化就是為了重復穩(wěn)定，易于質控。還要便宜，只有便宜了才適于大批量操作。所以，總體的目標就是大家會使用的而且是穩(wěn)定的方法。

我們需要一個分辨力強的分子分型方法，到底要強到什么程度?是不是一個菌株一個型、恨不得把一個微小的變異都描述出來?作為基因組的研究者來說，我們當然希望發(fā)現(xiàn)其中的任何差異，但是在流行病學應用上，我們要強調到什么分型程度。有時候太細了菌株稍有變化即被分成不同型，而暴發(fā)菌株引起暴發(fā)過程中，傳給不同個體，會發(fā)生微小變化，因此分辨能力太強了，可能會造成不必要的麻煩，一個共同來源的暴發(fā)菌株也被分成不同的型。分辨能力多少為合適?古語一段話，“東家之子，增之一分則太長，減之一分則太短，著粉則太白，施朱則太赤”，講的就是恰到好處。我們到底需要什么樣的分辨能力的方法?理想的就是能夠將共同來源的菌株聚成簇，并有別于其他不同來源的菌株；當然前提是共同來源的菌株在暴發(fā)傳播過程中基因組不變?，F(xiàn)實中有這樣的問題，菌株復制過程中基因組是要變的，但在一定時間內，不變或變化有限。所以，我們在流行病學上調查，就希望能夠找到分子分型方法不受小程度變異影響，或者是這個方法最好能夠容許微小隨機的變異。今天上午我們討論的一個問題就是，不同菌株分析出的序列有變化，則關鍵是這幾個菌株到底是不是一樣的。這個永遠是繞圈的問題，對于一個具體的暴發(fā)傳播，我們不知道細菌怎么變。

理論上，我們希望用一個分型方法，將暴發(fā)的菌株聚到一塊，將另外一個源頭來的不一樣菌株被分開。

有時候分辨力強也有一個問題，一個病人的標本有時可分到具有多種型別的一種菌株。例如海地霍亂的一次調查，他們也用MLVA方法，對病人采集糞便標本以后，標本不增菌，直接去做平板單菌落培養(yǎng)，挑不同單菌落進行分析。看結果，對于1號病人來看，菌株都是MLVA型別，4號病例的20個單菌落里有4個是MLVA的A型，7個C型，4個D型，4個H型，可見用MLVA從一個病人的標本中將不同菌落分成了多個型，那么到底這個病人感染了什么型的菌株?如果只挑一個菌落，將4號病人菌株分成了不同型，就可能認為這個病例感染了不同來源的菌株，會把流調人員的目標引到別的地方去。所以分型太細了也不行。

另外是要求快速，為什么要快速?無非是暴發(fā)應急的需求，要求盡快發(fā)現(xiàn)源頭，快速十預，減少病例。并且病例調查時，盡早確定病例并開展調查，能獲得更準確的信息。感染后從發(fā)病、分離、確認到分析是需要時間的，分子分型需要時間，時間如果太長，比如用了2周，可能感染危險因素已經沒有了，再也回溯不了。而且，2周以后再去找這個病例，詢問15天之前到20天之前吃了什么，確實是回答不了或回答很不準確。傳染病報告網絡做了以后，做出了較多的很好的溯源調查例子，但是目前看來激動人心的例子還主要是污染因素持續(xù)存在數(shù)周或數(shù)月，分析后再開展調查時，污染因素還在，這個時候能找到來源。

我們要求分型方法最好是非病原分離依賴的，就是針對標本、不分離菌株即可針對其中的病原進行分子分型，最主要的也是為了快速分型這一點，所以需求還是快速、靈敏。核酸檢測新方法測序技術等，可能會幫助我們來做快速分型。這個做起來很困難，大家提出來一些方法，無非還是要求分辨力強、簡便、重復性好、易于標準化、便宜、快速。問題就在于哪些方法是好的?，F(xiàn)在有很多的大規(guī)模測序，將整個標本的核酸序列全測出，要解決的問題是，如果我們從原始標本中直接測序，要知道擴增的片段是不是致病菌的，哪些是致病菌的，從樣本中大規(guī)模測序，怎么拼接片段，哪些片段是標本中正常細菌的，哪些片段是致病菌的。即便測序價格便宜了，如何讓序列拼接分析在網絡實驗室方便開展?這個結果能不能在不同實驗室進行比較?所以，現(xiàn)有的技術可能能夠解決一些問題，實踐中目前還是存在一些困難要克服。

關于分子分型方法的評價問題。一個重要的基礎方面是菌株選擇。一定要選擇流行病學不相關的菌株、暴發(fā)的菌株分別進行方法評價，并要求樣本量?，F(xiàn)在很多微生物學家缺乏流行病學的思維，描述一個全球流行的變異的時候，只有少量菌株就完成分析了。這里面缺乏了實際流行菌株的代表性，如果研究中樣本選擇的量和隨機性不夠，很多東西就被忽略了。

還有分型方法的參數(shù)比較與優(yōu)化，以及與其他方法的比較評價。再一個是選擇的分子分型方法能不能進行很好的質量控制，以及實驗室之間的比較問題。最近發(fā)布的副溶血弧菌分子分型的標準化方法，是經過不同國家的實驗室參與評價才發(fā)布出去，因此每一種分子分型方法都需要經過不同實驗室、不同菌株的大量評價。

關于圖譜比較問題，有時候我們使用相似度的百分比數(shù)值描述帶型相似的不同程度。如相似度86% ，97%，那么到底大于86%算一致還是大于97 %算一致?我們在做微生物學分析的時候，這些數(shù)據(jù)能夠幫助我們進行相對定量的分析，但是CDC不用這些數(shù)據(jù)，不設定判別界值。還要注意流行病學分析時不要求進化信息。在PulseNet中數(shù)據(jù)的比較，不是說把1萬個帶型放在一個數(shù)據(jù)集里面比較，這樣計算量極大。而是把待分析菌株的帶型與數(shù)據(jù)庫中已有所有帶型兩兩比較，這樣普通計算機也不會死機，目的是能否找到具有相同或非常相似帶型的那些菌株。所以CDC需要的技術和分析，與遺傳學分析、基因組分析還是有差別的。

基因組學家醉心于發(fā)現(xiàn)差別，流行病學家需要容許一些差別。當然這里面有一個問題，我們總想把所有的問題解決得完美，這在流行病學中是不可能的。我們是解決主要問題，不是解決100%的問題。我們做的各種分析的檢測，確實需要新技術、快速的技術、靈敏的技術，也不能太靈敏，也需要非經過病原培養(yǎng)的分子分型技術，這些都是擺在我們面前的挑戰(zhàn)。但截止到目前，我們還是需要盡可能多的菌株，然后盡快地進行分子分型。

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2、夏勝利：腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術探索

大家上午好!很高興能夠在這個平臺上與大家交流。這次我主要是結合河南省的實際工作來探索腸道傳染病病原快速鑒定與溯源技術的應用前景。

一、當前傳染病疫情的現(xiàn)狀

根據(jù)河南省近年來的疫情狀況并結合國內疫情情況分析，當前傳染病疫情，首先是新舊傳染病縱橫交錯。從20世紀80年代，我國的傳染病是穩(wěn)中有降，原因是疫苗和抗生素的廣泛應用。但是進人21世紀以后，新發(fā)再發(fā)傳染病再次流行，結核、鼠疫、霍亂等古老傳染病復蘇，艾滋病、埃博拉出血熱、瘋牛病、軍團病、萊姆病等50余種新發(fā)傳染性疾病開始流行。因此，目前傳染病仍是人類的主要死因，目前的局面給傳染病的預防控制工作帶來了新的壓力。

其次是外界環(huán)境的改變對細菌和病毒的影響。濫伐森林、土地流失、人口流動、城市擁擠、對野生動物的肆意捕殺等人類短視行為，迫使細菌和病毒因為生存的壓力發(fā)生基因變異，原來不致病的病原體變異為可致病，使得疾病預防控制工作越來越艱巨。

三是濫用抗生素與抗藥性菌株的流行。新舊傳染病在今天流行的原因是多方面的。目前，耐藥菌迅速增加，曾經很容易用抗生素治愈的一些疾病已無濟于事，這均由抗生素使用管理不嚴所致。美國傳染病專家休斯博士說，"一旦病菌產生了抗藥性，那么我們就徹底回到了抗生素發(fā)現(xiàn)之前的年代”。

再者，濫用生物武器。美國發(fā)生“911”恐怖事件，郵件使人感染炭疽病的事例，甚至SARS的傳聞等。如何防范以危害人群健康為目標的生物恐怖突發(fā)事件，已成為世人矚目的焦點問題。

二、流行趨勢一樣很嚴峻

(1)流行范圍廣、流行無疆界。這個與我們現(xiàn)代化的進程是分不開的。隨著國際貿易和旅游的發(fā)展，人口流動導致傳染病迅速擴散。艾滋病已遍布全球190多個國家。萊姆病、軍團病、消化性潰瘍、腎綜合征出血熱等其他20種疾病全球分布，另外，全球氣候變暖導致熱帶地區(qū)的媒介傳染病在亞熱帶地區(qū)出現(xiàn)。

(2)傳染性強、傳播速度快。一些疾病能通過飛沫傳播(馬爾堡出血熱、傳染性非典型肺炎等);一些則通過氣溶膠感染(拉薩熱、腎綜合征出血熱、漢坦病毒肺綜合征等);還有的則通過密切接觸傳播(埃博拉出血熱、艾滋病等);0139霍亂則通過水，EHEC 0104    EHEC O157通過食物傳播引起暴發(fā)流行。

(3)與動物關系密切。隨著人類行為的改變、社會的改變，動物源性疾病越來越凸顯;馬爾堡出血熱、拉薩熱、EHEC、萊姆病、禽流感等20種疾病與動物有關。

(4)病死率高、危害大。艾滋病已導致1300多萬人死亡，埃博拉出血熱、漢坦病毒肺綜合征、軍團病、禽流感等多種疾病的病死率很高。各種新傳染病帶來沉重的醫(yī)療費用負擔，也造成巨大的社會經濟損失。

三、傳染病檢測、鑒定及溯源技術

傳統(tǒng)的鑒定技術在基層用得比較多，例如鏡檢、培養(yǎng)和生化鑒定等。就細菌學鑒定方面，生化是認祖歸宗很重要的方法;另外，血清玻片凝集、乳膠凝集、噬菌體分型、試管凝集、補體結合試驗等也是很有效的病原微生物鑒定技術。

景懷琦教授言簡意賅地強調了生物資源的重要性。關鍵是如何拿到，如何采集到合格的標本。目前在基層很多經典的、傳統(tǒng)的方法被慢慢邊緣化了，越來越不被人們重視，再加上一些客觀原因，比如老一代技術人員退休，新一代跟不上來，很多過去能做的現(xiàn)在都開展不了。生物資源的發(fā)現(xiàn)、采集、保存、共享均需要一系列的機構甚至政策做保障。這次沙龍上所展示的很多新技術如何能夠跟實際工作相結合，將是非常大的挑戰(zhàn)。

目前基因擴增等快速篩查檢測方法，用于細菌的并不很多，應用最多、最成功的是在病毒的快速檢測上，包括多重PC R、基因芯片還有其他的分析技術。這些技術要在基層應用，還有一段的路要走，技術推廣和降低成本是關鍵。盡管我們有快速篩查的方法，最后還是要分離到真正的病原菌。

為了能夠有效提高現(xiàn)場檢出率，我設計了腸道病原菌快速鑒定的流程圖，應用該流程可從一份糞便標本中快速檢測8個主要腸道致病菌屬。其中的增菌培養(yǎng)、專用顯色培養(yǎng)基、KIA ， MIU和氧化酶篩查試驗，可有效甄別數(shù)十種不同菌屬。專用顯色培養(yǎng)基將是未來的一個方向，易于基層推廣。現(xiàn)場快速生化鑒定方面RapIDONE系統(tǒng)非常實用，4個小時內出結果，簡單快捷。另外，我們設計的對常見的腹瀉病毒的檢驗流程也非常實用，從前期采樣到病毒的篩查，到后期對5個腹瀉病毒的基因分型，很高效。利用這個框架，一旦出現(xiàn)疫情，走這個通道能夠迅速地對傳染病做出診斷。

楊瑞馥教授昨天強調，在新技術應用方面應遵照“表型為主、基因為輔”的路線，我認為非常貼切。事實上，新基因發(fā)現(xiàn)的資源很多，目前缺少的就是可操作性強的機制和平臺。微生物的表型是很容易得到，比如生長特性、營養(yǎng)條件、菌落形態(tài)、生化反應和血清學變化等，對于基層簡單而實用，能夠解決實際問題。比如說我們發(fā)現(xiàn)了志賀菌福氏4c( Fxv變種)，發(fā)現(xiàn)了福氏1d，還發(fā)現(xiàn)了福氏6(福氏Z變種)等新菌型，并在世界上首次以中國的菌種命名志賀菌，就是用傳統(tǒng)鑒定方法體系得到的。后期通過基因組測序，又從基因層面上證實了形成表型的基因變化，加快了人們對新菌型的認識和命名。這并不代表基因組測序方法更先進，或是傳統(tǒng)方法落后了，只是從不同層面去觀察一個事物。還有如耐藥表型也很重要。我在丹麥做研究時，僅根據(jù)我們分離的沙門菌株耐藥基因表型差別，發(fā)現(xiàn)了新的qnrD耐藥基因，并在Gene bank注冊。事實上發(fā)現(xiàn)新的東西并不困難，關鍵是要從眾多積累的信息中尋找到正在變化的表型，從中發(fā)現(xiàn)新的基因突變。

傳染病調查中，及時發(fā)現(xiàn)暴發(fā)、溯源和分析擴散趨勢，會有效促進防控策略的制定，并使措施更具有針對性，目前我們用得最多的溯源方法是PFGE      PFGE之所以在世界各地備受關注有它固有的原因，它是目前分子分型的“金標準”，能夠針對整條染色體分型，敏感、特異，重復性好，且分辨率高。分型結果的積累可迅速生成一個資源數(shù)據(jù)庫，如果該資源庫能夠實現(xiàn)全球共享，那么它所發(fā)揮的作用將無可替代。利用該資源庫，我們可迅速對比分析出病原菌的種類和來源，可迅速做到控制傳染源和切斷傳播途徑，保護人群遠離疾病。

另外，我們做了MLST ，MLSV方面部分病原菌對比分析工作?；谛蛄袦y定技術的MLVA在病原微生物的分子分型和暴發(fā)溯源方面有廣泛的應用前景，其方法更加靈敏、簡便、快捷和準確，人為誤差小，對軟硬件要求低，更易實現(xiàn)標準化和推廣普及。目前該技術為中國CDC " PulseNet”網絡實驗室推廣應用的第二代分子分型技術。

眾所周知，世界乃至宇宙每天都在變化，世間一切事物時刻都在變異，而我們所面對的微生物世界同樣在隨著世界和時間的變化，迫于免疫和藥物等生存的壓力，也在不斷選擇變化以求得生存。所以，進人21世紀，有50余種新發(fā)、再發(fā)傳染病再次流行。因此，加強疾病監(jiān)測仍是疾控中心今后的工作重點，只有監(jiān)測到位才可以實現(xiàn)對疫情的預警，各種前沿的溯源技術才能迅速跟進，增強我們對疫情的動態(tài)管理。一旦出現(xiàn)暴發(fā)苗頭，可以快速溯源，快速制定相關政策和控制措施，實現(xiàn)人類對疾病預防控制的終極目的。

四、檢測、鑒定和溯源技術評價和標準化

我相信大家所有的努力和技術的建立都是為疫情現(xiàn)場和疾病控制服務的，關鍵是如何轉化成果，技術方法如何標準化?，F(xiàn)在有很多公司研發(fā)了很多有用的方法，包括我們自己也有一些方法。問題在于如何評價它們的價值，評價它們的適用性，將來如何規(guī)范推廣，推廣以后如何再完善，等等，我們國家巫須這樣一個監(jiān)管機制。并且我相信，以建立此機制為契機，將會有很多的新發(fā)現(xiàn)和豐厚的回報。

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3、楊瑞馥：高通量核酸側序技術在應對新發(fā)、突發(fā)傳染病中的作用

測序技術給我們帶來兩大進步。一個是我們認識到生命是序列的，而且這個序列可以轉化為數(shù)字，所以可以用計算機來計算生命。隨著測序技術的發(fā)展，從過去的通量非常低、價格非常高的手工測序，發(fā)展到現(xiàn)在的高通量、價格非常低的新一代測序技術，所以我們現(xiàn)在有能力去大量測定人的基因組，測了以后我們會做以前不敢做的事情。目前在市場上比較流行的三種新一代高通量測序技術，現(xiàn)在已發(fā)展到第三代測序技術，此處不再贅述其原理。

高通量核酸測序技術發(fā)展這么快，我們可以在短期內快速獲得大量序列。在這種大的背景下，微生物學如何去做呢?在面對新發(fā)、突發(fā)傳染病的情況下，我們要研究疾病是怎么引起的，就是快速準確鑒定的問題。再一個是如何有效治療，要了解致病特征和治療藥物的選擇。同時，獲得了這些信息以后，巫須考慮的是如何控制傳染病，就是需要準確溯源，只有找到源頭在哪里，才可以對傳染病進行有效的控制。

這三個重要的問題都可以通過高通量測序來回答。這里舉一個例子：2011年德國大腸桿菌0104： H4暴發(fā)，從最原始的暴發(fā)到處置結束，大概三個月的時間。在這種情況下，在5月28口收到了德國寄來的DNA標本后，我們與深圳華大基因研究院一起，首先用第三代測序技術于6月2口獲得了原始數(shù)據(jù)，這個原始數(shù)據(jù)直接公布到網上。利用這些數(shù)據(jù)，我們和英國Nick博士很快公布了組裝結果，經過大量的分析，獲得了大量的基因組轉移、致病相關基因和耐藥與抗性基因等情況。在這個過程中就發(fā)展了一種應對突發(fā)疫情的新機制，即開源基因組學。過去的做法是，一個或幾個研究小組拿到標本以后，將其作為一種重要資源，不會很輕易讓人來分享，只有文章發(fā)表后才會公布序列與國內外同行分享；我們做的機制是拿到基因組原始數(shù)據(jù)后實時公布到網上，我們自己還沒有分析，就供全球科學家下載分享。截至2011年6月底，序列被下載近15000次，也獲得了各個國家專家的分析報告60多份，我們再綜合全球的分析，獲得結論。通過這個合作，我們把有突出貢獻的人列為共同第一，參與實驗室的課題負責人一起作為共同通訊作者共同發(fā)表。在這些作者當中，大部分人都沒有見過面，只用兩個月的時間把數(shù)據(jù)公布發(fā)表。同時，因為有大量的人員參加，我們又篩選了一些貢獻比較大的人員列到附件里面，作為工作小組成員，承認他們對大腸桿菌的測序工作的貢獻。

2012年在英國出現(xiàn)的類似SARS的病毒，迫于輿論和各國的壓力，英國僅公布了部分結果，沒有把全部結果無條件地放到網上讓全球科學家共享。如果實施開源基因組學共享機制，全球科學家都知道序列，就會很快建立應對措施。所以，也希望全球科學家繼續(xù)達成共識，將這個新機制發(fā)揚光大。

再舉一個例子，2010年海地地震以后發(fā)生的霍亂。截至2011年1月造成17萬人感染，3000多人死亡。有一個說法說霍亂是由美國部隊的救援人員從尼泊爾到海地救援的時候把細菌帶來的，但是一直沒有100%的證據(jù)，都是新聞媒體報道。美國一個研究小組收集了尼泊爾的菌株和海地暴發(fā)的菌株，通過全基因組序列鑒定，可以清晰地看到，尼泊爾的和海地的差異非常小，只有一兩個SNPs差異。該工作100%給出了證據(jù)，即海地霍亂暴發(fā)菌株的確來自尼泊爾，至于是不是美軍帶過去的，還需要其他的證據(jù)，要考慮是不是從美國的士兵拿到這個病原進行分析，就是100%的證據(jù)。英國SANGER測序中心把第七次霍亂大暴發(fā)菌株進行了測序，分析了耐藥情況和一些毒力基因的情況等，通過遺傳發(fā)育分析可以清楚地看到三個階段：第一個階段60年代之前，在使用這兩個抗生素之前，細菌沒有耐藥性，使用之后，耐藥性現(xiàn)在逐漸達到了100 %，霍亂菌株都攜帶這兩個抗生素的耐藥基因，同時勾勒了第七次霍亂大流行全球的傳播路線。

再舉一個例子，美國一個實驗室鼠疫的感染，這位老先生60歲了，馬上就退休，但是發(fā)現(xiàn)感染了肺鼠疫，住院后很快就死亡了，但是他在實驗室做的菌株是一個弱毒，是一個疫苗株，對人不致病。但通過測序鑒定，他感染的菌株和實驗室的菌株是100%一樣的，也就是說這起感染是由實驗室的弱毒株所致的，為什么能感染呢?后來解剖學證明，他患有高鐵血癥，我們都知道，細菌侵人機體后需要和機體競爭鐵離子才能生存，弱毒株就是缺失了編碼奪鐵能力的基因片段，但該患者患有高鐵血癥，血液中有足夠的自由鐵離子供細菌生長，因此，在實驗室操作弱毒株也要注意生物安全問題。繼續(xù)講一個鼠疫的例子，我們和愛爾蘭、美國、法國一些實驗室合作，通過測序和 SNPs分析來追蹤歷史上鼠疫三次大流行的研究。我們分析證明，第三次大流行是從我國傳出后，通過商貿傳播到世界各地。第二次大流行和絲綢之路相關；文獻也有報道，炭疽和麻風病等的傳播都和絲綢之路相關。第一次大流行可能和鄭和下西洋的活動相關。

前面幾個例子說明了用全基因組測序不只可以追溯現(xiàn)在的感染，還可以追溯歷史的感染。通過全基因組測序可以給一個100%的證據(jù)，來說明由某種病是否由某個病原導致的。例如 600多年前的中世紀疫情導致了羅馬帝國的滅亡，但是學術界一直有個疑問，就是此次瘟疫是否是鼠疫導致的，有人提出可能是霍亂。一篇發(fā)表在N ature上的文章說，將死于那場浩劫的尸體挖出來，把牙髓里面的鼠疫菌DNA通過基因芯片都捕獲下來，然后做全基因組測序，證明了那次浩劫的確是鼠疫導致的，給出了一個完美的證據(jù)。

我們實驗室還做了一個工作，就是把中國和蒙古國的鼠疫菌DNA拿來做全基因組測序，分析了他們之間的遺傳發(fā)育規(guī)律。同時也證實了在傳播暴發(fā)過程中，菌株的DNA變異累計加快。據(jù)此，我們提出了一個假設，傳染病在暴發(fā)的過程中有一個突變加速的過程，這給疾病檢測和疾病防控帶來了新的挑戰(zhàn)，但用全基因組測序的辦法可以很快和準確地鑒定出這些變異。

通過比較基因組學分析，我們利用鼠疫菌的所有變異信息建立了一個數(shù)據(jù)庫，用于菌株的溯源。2009年在青海有一次肺鼠疫的暴發(fā)，經過全基因組序列分析，得出這次暴發(fā)是由一只牧羊犬導致的。過去一直認為狗中抗鼠疫抗體的升高，可以作為一種監(jiān)測野生動物宿主感染鼠疫的指標，因為認為狗對鼠疫不敏感。我們的分析首次給出了直接的證據(jù)證明狗同樣可以把鼠疫傳播給人，導致鼠疫的暴發(fā)流行。

對于溯源工作，我們過去是通過分子流行病學技術來實現(xiàn)。但是，在美國"911”炭疽白色粉末生物恐怖襲擊以后，給溯源提出更高的要求，不只要溯到來源在哪里，更重要的是要作為直接的證據(jù)把施放者送到法庭上，作為呈堂證供。因此，微生物法醫(yī)學也就應運而生，包括微生物學技術、計算機技術、公共機關、法律等不同領域的人員交叉來發(fā)展這個學科，當然，發(fā)展這個新學科的關鍵是和法醫(yī)學必須要有一個指紋數(shù)據(jù)庫一樣，要想實現(xiàn)微生物法醫(yī)學溯源，我們也需要一個數(shù)據(jù)庫。從目前來講，DNA的成分是最穩(wěn)定的，分析技術也是最成熟的，所以目前大家還是致力于建設各種微生物的DNA數(shù)據(jù)庫，除了一些間接的分析方法(如PFGE，MLST和VNTR等)外，全基因組測序會給我們帶來更精確、更準確的溯源結果。美國的炭疽最后溯源到疑犯也是靠基因組測序，但因為這個疑犯后來自殺了，這個事件的溯源調查也就畫上了句號。

在日本有一個奧姆真理教，在東京地鐵釋放了沙林，很快警方查到了他們生產沙林的工廠。在最后審問的時候，才得知他們在工作大樓上安裝了一個氣溶膠發(fā)生器，他們發(fā)生過炭疽芽抱等。后來工作人員進行了調查，從樓頂和臨近區(qū)域分離到了炭疽芽抱桿菌，用MLVA的方法分析證明，他們使用的菌株就是動物疫苗株，再次證明了分子生物學方法進行精確溯源的價值。

下面再舉一個例子，美國一家醫(yī)院ICU病房新生兒耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的調查。他們對部分來自關鍵部位的分離菌株進行全基因組測序分析，清楚地展示了這些菌株在醫(yī)院的傳播規(guī)律，為醫(yī)院院內傳播的預防控制措施的實施提供了很好的科技支撐。該研究還提出了兩個新概念，即菌株的耐藥基因譜(resistome)和毒力基因譜(toxome，前者就是所有抗性基因構成的圖譜；后者就是毒力相關基因的分布情況。通過直接測序，只要獲得這兩個組就可以直接判定選用哪些抗生素治療，知道毒力情況就可以判定菌株的毒性和如何處置。

下面這個例子是加拿大社區(qū)的一個結核傳播感染的調查。此次疫情主要是吸毒者中進行傳播，他們進行了一系列的分析，找到病例之間傳播的關系和路線，能和所有人員的社會活動關聯(lián)起來，也可以和微生物結果和臨床數(shù)據(jù)關聯(lián)起來，這是首次將社會網絡與高分辨的基因組測序結果結合，通過這種復雜的分析，促進了結核暴發(fā)的溯源調查。同時顯示，基因組序列分析可以有力地促進流行病學調查結果的完善，并且一個結核分枝桿菌的基因型包含有足夠的遺傳多態(tài)性來勾勒菌株間的精細關系，以改進流行病學調查的結果。

最近美國FDA(食品和藥物管理局)公布了一個計劃，他們準備測序10萬株食源性病原菌基因組，測序的平臺選的是Illumina的MiSeq，準備花17億美元用5年的時間來完成這個工作。不久的將來，針對食品相關細菌病原傳染病的暴發(fā)，就可以用這個數(shù)據(jù)庫進行快速和高精度的溯源分析了。當然做的都是美國的菌株，如果能很好地實現(xiàn)傳染病的國際溯源，要形成很好的國際合作。我們國家也啟動了相關工作，就是整個細菌病原的測序工作，跟美國的想法類似，只是投人太少。這也需要我們通過專家在不同的場合去繼續(xù)呼吁，如果我們不去做，外國人做好后，我們按人家的去套用，是可以使用，但是失去了對人類染病溯源做出領銜貢獻的機會。

前面講的都是一些針對具體病原菌株的基因組測序工作。在像河南新型bunyavirus病毒鑒定過程中，深圳華大基因研究院和河南疾病預防控制中心聯(lián)合用Metagenomics直接從人的血清里面就可以鑒定出該病毒的基因序列。

所以，高通量測序技術給我們帶來了前所未有的機遇，包括新病原的發(fā)現(xiàn)與快速鑒定、新分型技術的發(fā)展，基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫的建立與精確溯源，還有致病與耐藥基因的揭示，當然，還可以用于大量的基礎研究工作。

雖然有機遇，但我們仍面臨著挑戰(zhàn)：在技術平臺方面，我們國家的測序平臺非常多，包括深圳的華大基因研究院已經成了全世界最大的測序中心，和一些小的測序公司以及很多單位的測序平臺，如何發(fā)揮這些平臺在應對新發(fā)突發(fā)傳染病中的作用，這是我們需要考慮的問題。所以，在國家層面上，必須有個大的測序中心，時刻準備著為這個事來服務，如華大基因研究院，就應該給予固定的支持，建立一種測序技術應對全球新發(fā)突發(fā)疫情的機制。我也相信，華大會感興趣為全球和我國的公衛(wèi)事業(yè)服務。

資源共享方面，大家拿到傳染病病原的未知標本和資源，一般都當做寶貝自己來研究，這個進程很慢，不會很快，如果要想快速地了解病原，應用全球的智慧共同應對，如何應對?資源共享是我們應該值得考慮的問題。和這兩個問題聯(lián)結在一起的，最關鍵的是合作機制的建立。對德國大腸桿菌研究的就是一個成功的案例，我們定的一個原則就是，誰提供標本誰就是第一單位、第一作者，因為標本最重要，所以給標本提供者最大的機會，盡管后續(xù)的工作他們可能參與的比較少。隨著工作的進展，視對整個工作完成的貢獻，大家再商議如何排序署名問題。如果這種共享和發(fā)表機制定下來，大家很快地就會達成共識。

在數(shù)據(jù)庫建設方面，如果針對的是列到生物恐怖病原清單的細菌，我們需要和國內外同行協(xié)商，用什么技術平臺來建立這個數(shù)據(jù)庫，如何共享。對于鼠疫菌而言，我們在與國際同行的溝通中了解到，大家非常樂意合作來共同建立一個溯源數(shù)據(jù)庫。幾位有共識的科學家2012年在美國開了一個會，2013年將在蘇州再開一個會，在那個會上我們會定一下怎么利用公共的平臺，利用全球的資源來建立好鼠疫菌溯源的數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)多贏共享。從我們國家的思維方式來講，大家都愿意在一個單位把所有的事情都完成，但對溯源數(shù)據(jù)庫這個事業(yè)來講是不可能的。所以在這種新的大平臺、新合作機制的要求下，如何打破部的利益，建立一個精準的溯源數(shù)據(jù)庫是值得我們思考的。如果有一個共同目標，就容易抓住機遇，為世界傳染病暴發(fā)溯源和鑒定工作做出我們應有的貢獻。

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4、扈慶華：食源性疾病的快速診斷和溯源

我主要是向各位專家匯報我們這幾年開展的食源性疾病的快速診斷和溯源技術研究工作，把研究工作中存在的問題提出來，也希望各位專家能夠給予解答。

食源性疾病是最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，世界衛(wèi)生組織估計，全球每年發(fā)生40億——60億例食源腹瀉。食源性疾病在我國主要表現(xiàn)為細菌性食物中毒，還有感染性腹瀉。食源性疾病在導致人民健康受到威脅的同時，還造成巨大的經濟損失。如2011年德國發(fā)生的0104： H4腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情。深圳每年也有食物中毒發(fā)生。

食源性疾病或感染性腹瀉主要是由攝人受病原微生物污染的食品而引起的，而食品安全是一個復雜的問題，食品的生產涉及原料生產、加工、零售、流通等環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都有可能受到病原微生物的污染，這對我們在處置食源性疾病暴發(fā)疫情時提出了更高的要求，需要快速準確地確定病因和進行溯源，需要回答2個問題：①是什么。引起食源性疾病暴發(fā)的病原菌是什么?②從哪里來。傳染的源頭在哪里?

食源性疾病由多種致病病原引起，需建立多種病原體的快速檢測方法和溯源技術平臺。

目前在我國，引起食源性疾病的常見病原體有七八種，但是在國外每年暴發(fā)的食源性疾病病原有多種，目前認為引起食源性疾病的病原體有40-50種，包括細菌、病毒和寄生蟲。

傳統(tǒng)檢測技術操作復雜、檢測時間長，現(xiàn)有的快速檢測技術主要包括熒光PCR技術、免疫學技術、液相懸浮芯片等。

對于我們來說，在現(xiàn)場應急處置時需要比較快捷、簡便的方法，我們認為比較好的方法應該是操作簡單、重復性好、快速，特別是能在基層實驗室推廣使用的。現(xiàn)在PC R方法是不容置疑的，目前比較成熟的是單色的、雙重熒光PCR方法，不成熟的方法有4重或以上的熒光PCR方法，急需改進和優(yōu)化。

因為2002年的食物中毒暴發(fā)疫情多，現(xiàn)場處置需要一個快速準確的結果，所以我們選擇了中通量檢測技術平臺進行快速檢測方法研究，包括多重熒光PCR技術和液相懸浮芯片技術。我們以探針編碼(改良分子信標)、探針溶解曲線為核心技術基礎，開展多重熒光PCR方法研究，檢測的病原體種類有37種細菌、5種病毒、2種寄生蟲。液相懸浮芯片當時在國外做得比較多，因為芯片通量比PCR高，我們也開展了液相芯片檢測多種食源性致病菌的方法研究。我們主要是想做這兩個平臺技術的研究。

多重熒光PCR是2002年開始做的，最低檢出限大概是1-6cfu/mL。熒光PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的比較，靈敏度和特異度均為98%以上，所以熒光PCR方法是可以用于食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的早期診斷。同時也用了Kappa檢驗驗證多重熒光PC R方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。從2003年開始進行現(xiàn)場應用，成功地應用于深圳地區(qū)100多起食物中毒的快速診斷和腸道傳染病的快速檢測，如沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、大腸桿菌0157：H7等。

在多重熒光PC R研究的基礎上，我們開始建立應用液相懸浮芯片檢測多重致病菌的方法，做完發(fā)現(xiàn)其靈敏度并不是很高，大概是104-105 cfu/mL。通過這幾年的研究，我自己感覺任何技術都不可能包打天下，熒光PCR做到一管檢測10個靶基因，即10重體系可以再提高檢測通量需要技術的改進。液相芯片技術最大的一個缺點就是磁珠依賴進口，所以我也想趁這個沙龍建議，我們國家科技重大專項投了這么多錢，是否可以嘗試研制我國的磁珠替代國外產品，降低檢測成本。

通過這幾年研究，我的個人體會是：對于已知病原體的快速篩查，開發(fā)系列多重熒光PC R試劑盒(5-10種病原體/管)，利用網絡實驗室的優(yōu)勢，組織多個實驗室驗證，進行推廣使用。同時在國家參比實驗室、有條件的省市級CDC建立液相芯片的技術平臺，并進行方法的標準化。對于未知病原體的篩查，可采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術、全基因組測序等。

關于溯源技術，昨天闞副所長講了很多，我們實驗室主要是在分子分型方法的評估、標準化和應用方面做一些工作。我們要評估一個方法必須要找一個標準方法，所以還是重點把PFGE方法建好，并用于暴發(fā)疫情的調查。同時我們也優(yōu)化MLVA和采用MLST分析本地菌株與其他各省或國家菌株的關系。在成功應用PFGE進行單點暴發(fā)疫情調查的基礎上，我們希望建立一個更靈敏的分子分型監(jiān)測方法，用于暴發(fā)疫情的早期發(fā)現(xiàn)。我們建立了以醫(yī)院為基礎的實驗室監(jiān)測系統(tǒng)，在此基礎上建立PulseNet監(jiān)測網絡(即細菌性傳染病分子分型監(jiān)測網絡)，希望把調查提前，不是出現(xiàn)暴發(fā)再去調查。建立的分子分型監(jiān)測網絡(PulseNet China)主要用于暴發(fā)疫情的追蹤溯源和暴發(fā)疫情的早期發(fā)現(xiàn)。

應用PFGE進行溯源的成功案例，如2005年腸炎沙門菌食物中毒的溯源、金黃色葡萄球菌中毒溯源等。這些都是出現(xiàn)單點暴發(fā)開展的溯源，這些單點暴發(fā)都必須要拿到菌株，然后才可以確認源頭。另外我們開展了副溶血弧菌M LVA方法的評估，因為流行病學專家經常說PFGE方法太慢了，通常從標本采集、菌株分離到分子分型，需要2周。我們希望將來溯源的模式采用以PCR為基礎的技術進行源頭的確認。我們篩選了225株有明確流行病學背景的副溶血弧菌菌株進行MLVA方法評估，我們認為6個位點就足以進行副溶血弧菌的MLVA分析。

深圳的183株副溶血弧菌的M LST分析，共有4個克隆群，其中CC120是深圳獨特的克隆群。我們查了一下流行病資料，這個克隆群與食物中毒暴發(fā)是有關系的。

其實我們最想做的就是實驗室早期提示暴發(fā)，當出現(xiàn)少數(shù)病例時展開調查，而不是出現(xiàn)大量病例時再去做調查。通過這個結果，可以看到每年病原的構成和陽性率趨勢，所以我們希望將來做病原陽性率的基線和優(yōu)勢分子分型條帶數(shù)的基線。腹瀉檢測、食物中毒應該和食品安全結合起來，所以舒所長講為什么加拿大、美國的PulseNet做得那么成功，我覺得是因為他們把食源性疾病分子分型監(jiān)測(PulseNet USA，PulseNet Canada)作為一個常態(tài)工作，每年投人了大量經費和人力開展此項工作，而不是單純的科研投人，是暴發(fā)疫情早期發(fā)現(xiàn)和源頭追蹤的重要技術支撐，是食品安全保障的重要工作內容。我們想做這個嘗試，當然也不可能完全照搬，所以我們首選副溶血弧菌和沙門菌，準備利用5年的PFGE數(shù)據(jù)，設置移動平均線，用于副溶血弧菌和沙門菌感染的暴發(fā)疫情的早期預警。

目前關于溯源存在的問題：第一，不同病原體，其細菌基因組結構是不同的，有些細菌的分子分型技術的分辨力不足，如腸炎沙門菌的PFGE分辨率不夠。第二，何時啟動調查，如何調動流行病學專家的積極性，確認暴發(fā)和溯源，是目前的瓶頸。因為區(qū)別現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的成簇病例是暴發(fā)還是一個常態(tài)的基線數(shù)據(jù)，需要流行病學調查來證實分析結果，這幾年我們做了一些嘗試：即通過發(fā)現(xiàn)成簇病例，啟動流行病學調查確認暴發(fā)，但是啟動調查后，沒有發(fā)現(xiàn)成簇病例之間的相關性。第三，我國未建立從農場到餐桌的食品安全溯源體系，導致溯源難。如在歐洲，每個到餐桌的雞蛋都編了號，從哪個農場出來的，所以他們溯源就比較容易。當然還有我們自己銷售的特色，就是很多食品都是在農貿市場、流動攤檔購買，也增加了溯源的難度。

最后就今天的報告做一小結，第一，因為病原體的復雜多樣性，所以只有結合培養(yǎng)技術、PCR、蛋白質組學和測序技術等多項技術，才能應對常見食源性疾病暴發(fā)和新發(fā)傳染病的出現(xiàn)。第二，建議國家多部門合作，通過研發(fā)或引進，制系列快速檢測方法，在全國選擇10-15家實驗室進行多重熒光PCR方法、液相芯片方法的驗證，形成SOP文件，在全國推廣使用。其實我國的資源很多，應該在新發(fā)傳染病的發(fā)現(xiàn)方面有所貢獻。第三，不同的溯源技術解決的科學問題不同，需結合實際疫情處置和流行病學證據(jù)，進一步驗證溯源技術的分辨力，形成標準化的方法。標準方法就是要很實用，只要能把一次暴發(fā)解釋清楚、回答清楚就可以了。每個技術都不可能是完美的，各有互補。第四，開發(fā)適用于不同層次單位使用的檢測技術和溯源技術，形成不同水平的技術平臺，解決不同的傳染病防控問題。希望國家級的研究機構在開發(fā)這些技術的時候，還要考慮一些實用性，有些通量高的技術在國家層面進行研究，有些技術要考慮推廣。其實我們現(xiàn)在很多疾病監(jiān)測做不起來，原因是技術方法不是很好?，F(xiàn)在開展的疾病監(jiān)測系統(tǒng)，最終要覆蓋到醫(yī)院，盡量有一些簡便、簡單的方法就可以了，所以這個需要我們不同的平臺解決不同的問題。

我們和廈門大學李慶閣教授合作很多年了，還得到了中國CDC徐建國所長、闞飆副所長的大力支持。